此前，艾伟拓产品团队通过多期软文与视频，分析了生物制剂中缓冲体系的重要作用及筛选考量，欢迎您前往艾伟拓公众号对之前的几篇文章进行回顾。

本期，艾伟拓产品团队延续这一话题，对抗体等蛋白制剂在纯化工艺中的缓冲体系选择进行讨论。

抗体等蛋白类生物制剂的聚集，可能会影响产品的潜在免疫原性，其电荷异质性也可能影响treatment的安全性和有效性。

此前，我们主要将目光聚焦于成品制剂的稳定性。但值得注意的是，抗体蛋白在加工纯化等工艺过程中的稳定性也需要给予关注。为此，艾伟拓产品团队结合一篇来自印度理工学院的研究论文，对抗体蛋白纯化主要工艺步骤中的缓冲体系选择进行讨论。

01 蛋白A亲和层析

蛋白A亲和层析是抗体产品纯化工艺中普遍存在的捕获步骤，Protein A的成功是由于其独特而重要的能力，可以有效地捕获抗体蛋白产物(回收率为95-99%)，同时去除绝大多数宿主细胞杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)。

蛋白A的洗脱通常在低pH下进行，随后在低pH下进行病毒失活。然而，低pH与抗体蛋白的聚集有关，这是由于Fc结构域的结构变化导致洗脱过程中可溶性高分子量聚集体和/或不溶性沉淀物的增加。

使用SEC（分子排阻色谱）分析抗体聚集(图1A)。可以看出，在4°C和30°C下，即使在无盐缓冲液中保存长达7天，抗体蛋白聚集程度的增加也很小。only的例外是柠檬酸缓冲液，即使在没有盐的情况下也能观察到相当数量的聚集。

盐的加入(离子强度~0.2 ~ 0.3 mol/L)几乎在所有情况下都能突出提高抗体蛋白聚集程度，在30℃时效果更明显。

由此可以得出初步结论：

① 盐和高温的结合导致抗体蛋白聚集性突出增加；

② 与醋酸盐和甘氨酸缓冲液相比，柠檬酸缓冲液倾向于导致更高的蛋白聚集，特别是在高温下。

因此，建议在低温条件下进行蛋白A亲和层析并保存层析产物，如果保持在较高的温度下，则产物保持时间应限制在几个小时内，尽快进入下一个纯化处理步骤。

02 阳离子交换层析

对于抗体类药物而言，蛋白聚集是较大的不稳定性来源。此外，电荷异质性也会导致抗体蛋白的产品异质性。

离子交换层析广泛应用于抗体蛋白纯化工艺，研究表明该步骤中电荷异质性是影响抗体蛋白稳定性的主要因素。图3A为该研究选择的不同缓冲条件下抗体蛋白电荷异质性随时间的变化数据。

从总体上看，随着时间的推移，主峰含量呈下降趋势，其中磷酸盐缓冲液(pH 6.5)的下降幅度较大，磷酸盐缓冲液(pH 7.5)的下降幅度较小。同时，盐的加入使主峰含量降低。

对于醋酸盐和柠檬酸盐缓冲液，发现主峰含量在1周内的变化为小于2%。

在pH为6.5时，磷酸盐缓冲液中抗体蛋白的主峰含量发生了明显变化，从图3B中可以看出，时间和pH值对带电变异体的形成都起着重要的作用。

从图3A中也可以看出，在pH为7.5时，磷酸盐缓冲液中抗体蛋白的主峰含量变化可以忽略不计，而在pH为6.5时，相同的缓冲液发生了突出变化。在pH值为6.5时观察到的一个有趣现象是，随着时间的推移，主峰含量先降低后增加。

03 阴离子交换层析

图4A显示了所选择的不同缓冲条件下(Tris-HCl pH 7.2和Tris-HCl pH 8)主峰含量随时间变化的数据。可以看出，在pH 7.2时，变化不突出。

然而，在pH值为8时，抗体蛋白产物的电荷异质性发生了相当大的变化，在较高的温度下变化更大。盐的存在对主峰含量的影响很小。

图4B展示了统计建模的结果。可以看出，与阳离子交换层析一样，pH和时间对确定主峰含量起关键作用。

与之前一样，用pH为8的Tris-HCl缓冲液对数据构建等高线图。可以看出，随着温度的升高，设计空间减小。允许的离子强度随着保持时间的增加而降低，直到100 h后超过允许的极限。在30℃时，离子强度不建议大于0.05，纯化中间产品保持时间不建议超过60h，以避免主峰含量低于限度。

04 讨论

低pH导致抗体蛋白聚集。在远离pI的低pH条件下，抗体蛋白是高电荷的，导致电荷排斥，这使蛋白构象不稳定，这种结构扰动会促进抗体的展开介导聚集。这是常规蛋白A层析和病毒灭活过程步骤的条件下抗体蛋白突出聚集的主要原因。

在高pH (pH 8，接近蛋白的pI)的条件下，观察到抗体蛋白的电荷异质性增加。主峰含量的下降是由于酸性变体的增加导致。天冬氨酸残基的脱酰胺化是导致抗体降解和疗效下降的常见原因。这也是电荷异质性在离子交换层析步骤中突出影响蛋白稳定性的主要原因。

05 小结

该研究发现，蛋白聚集是蛋白A亲和层析和病毒失活步骤较大允许保持时间的主要决定因素，而电荷异质性的变化决定了阳离子交换和阴离子交换步骤的较大允许保持时间。这其中，适宜缓冲体系的选择对抗体蛋白在纯化过程中的稳定发挥着很大的作用。

在常见的蛋白A亲和层析条件下，高离子浓度和高温会导致抗体蛋白聚集突出增加；缓冲体系选择方面，与醋酸盐和甘氨酸缓冲液相比，柠檬酸缓冲液倾向于导致更高的蛋白聚集。而在离子交换层析中，离子强度、温度及pH值对抗体蛋白的电荷异质性有较大影响。

总而言之，除了制剂中的缓冲体系，还应关注抗体等蛋白制剂在蛋白纯化等过程工艺步骤中的缓冲体系选择，不同的缓冲体系（种类，pH，离子浓度）会对抗体蛋白的稳定性产生不同程度的影响，直接影响中间产物的较大允许保持时间，进而影响抗体制剂的稳定性与treatment效果。

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