1.研究背景

脂质纳米颗粒（LNP）是mRNA递送的核心技术，但长期冷冻保存会破坏LNP结构。由于LNP内部可含高达30%的水分，冷冻时，缓冲液结晶、pH漂移会破坏LNP膜结构，导致mRNA泄漏和转染效率下降。而缓冲液的选择是其中常被忽视的关键因素。

一项发表于 Molecular Pharmaceutics 的研究《Leveraging Biological Buffers for Efficient Messenger RNA Delivery via Lipid Nanoparticles》系统比较了三种常用缓冲液——HEPES（HBS）、Tris（TBS）和磷酸盐缓冲液（PBS） 对DLin-MC3-DMA mRNA-LNP冻融前后性能的影响。结果证实：HEPES在保护LNP、维持体内外转染活性方面显著优于PBS。

2.核心发现

（1）HEPES在冻融后能维持LNP均一形态并形成独特的“沙漏状”结构

新鲜制备时，三种缓冲液中的LNP在粒径、分布和包封率上并无差异。但经过冻融后，PBS和TBS中的LNP出现了明显的聚集和大量小颗粒，而HEPES组不仅保持了均一的分布，还形成了独特的“沙漏状”形态。这种形态变化可能反映了脂质膜的重组或局部去湿，为后续增强内体逃逸提供了结构基础。

（2）HEPES能有效抑制冻融诱导的脂质膜膨胀

冻融过程会显著增加LNP脂质膜的水合程度，导致膜结构松散、双层厚度增加。相比之下，HEPES缓冲液中的LNP在冻融后膜水合变化最小，脂质双层厚度增幅远低于PBS和TBS组，表明HEPES能够有效维持脂质膜的致密排列，抑制冻融引起的膜膨胀，从而保护LNP的结构完整性。

（3）HEPES在体外转染中表现出最优的冷冻保护能力

在不同细胞系中，HEPES缓冲液均展现出最佳的冷冻保护效果。冻融后，HEPES组的转染效率损失最小——在HeLa细胞中远低于PBS组，在HEK293T/17细胞中甚至无显著下降。而PBS和TBS组均出现不同程度的转染效率下降，说明HEPES能更好地保留LNP的体外功能活性。

图1 不同缓冲体系对mRNA-LNP细胞相容性与转染表现的影响

（4）HEPES冻融后反而增强内体逃逸能力

令人惊喜的是，HEPES不仅保护LNP免受冻融损伤，还在功能上带来了额外收益。冻融后，只有HEPES组的内体逃逸标志（Gal9募集）显著增加，而PBS和TBS组未见增强甚至有所下降。这一现象可能与HEPES诱导的“沙漏状”形态变化有关，提示HEPES缓冲液能够将冻融过程转化为有利于递送的结构重组。

图2 不同缓冲体系对细胞 Gal9 激活的影响

（5）HEPES在体内表达中冷冻保护效率最高，PBS表现最差

尽管新鲜LNP中TBS组的体内表达信号最强，但冻融后4小时的绝对表达量已无统计差异。若从冷冻保护效率（即保留率）来看，HEPES组的总通量下降幅度最小，PBS组下降幅度最大，损失近9倍。综合考虑绝对表达量与保留率，HEPES是比PBS更优的LNP冷冻储存缓冲液选择，而PBS最不推荐使用。

3.总结与启示

HEPES和Tris缓冲的LNP在体外和体内转染中整体优于PBS。HEPES尤其出色，冻融后体内活性保留最佳，内体逃逸甚至增强。

PBS虽最常用，但冻融后体内活性损失高达9倍；而HEPES通过维持粒径、抑制膜膨胀、诱导有利形态变化，显著保护了LNP的递送功能。

在mRNA-LNP的冷冻保存工艺中，不应默认使用PBS。选择HEPES缓冲液可显著提升冻融稳定性，保障产品批间一致性与药效。